柱层析

（Column Chromatography）

一种常用的分离和纯化混合物中不同成分的实验技术。其基本原理是利用样品中各成分在固定相和流动相之间的不同分配系数，实现分离，并得到目标

注意事项

固定相

在柱层析中，硅胶和氧化铝是最常见的两种固定相。硅胶一般是弱酸性的，而氧化铝有碱性、中性和酸性的区别。对于酸稳定的物质分离，可以选用硅胶；在硅胶表面会分解的物质可以考虑使用氧化铝。固定相的用量通常取决于以下几个因素：

● 样品量：需要依据待分离样品的量来确定硅胶的用量，一般建议固定相的量为样品量的10–20倍。

● 柱子的尺寸：柱子的直径和高度会影响硅胶的用量。柱子越大，所需的固定相量也越多。硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右，太短了影响分离效果，太长了也会由于扩散或拖尾，从而影响分离效果。对于复杂的混合物，可能需要更多的固定相以提高分离效果。

● 流动相的性质：不同的流动相也可能会影响硅胶的选择和用量。

● 对于烯烃、反式脂肪等难以分离的弱极性化合物，往固定相中加入银盐(AgNO3)，可以提高分离效果，有时甚至可以分离烯烃E，Z异构体。

流动相

合适的流动相是保证最佳分离效果的关键。一般选择流动相时需要考虑的几个方面：

● 极性：流动相的极性应与待分离成分的极性相匹配。通常，极性较大的成分应使用极性较强的溶剂，反之亦然。常用混合溶剂例如石油醚–乙酸乙酯、二氯甲烷–甲醇等作为流动相，极性可以通过二者比例进行调节。通过TLC薄层色谱可以进行流动相的初步筛选。一般而言，在TLC中保证分离目标物的Rf值为0.2–0.5的展开剂可作为合适的流动相。

● 溶解性：尽量确保流动相能有效溶解待分离的成分，以便它们能够顺利通过柱子。

● pH值：对于某些化合物，pH值会影响其离子化状态，从而影响分离效果。选择合适的pH值可以提高分离效率。例如，在硅胶柱层析胺类(生物碱)类物质、对酸敏感的缩醛(酮)类化合物时，可以在流动相中加入少量(0.1–1%)的三乙胺，可以减少硅胶柱对胺类物质的吸附损失，也可以避免敏感官能团的分解。

● 洗脱顺序：根据样品中成分的极性和性质，选择合适的洗脱顺序，可能需要使用梯度洗脱（逐步改变流动相的极性）。特别是TLC显示目标组分上方有小极性的杂质需要除去时，采用逐步加大流动相极性的梯度洗脱办法可以显著提高柱层析的效率。

● 此外，流动相溶剂的粘度、挥发性、毒性等因素也需要进行考虑。

实验步骤

层析柱的填充

● 准备柱子：确保柱子清洁干燥，完好无损。

● 选择固定相：根据实验需要选择合适的固定相，并准备好所需数量。

● 填充柱子：将固定相缓慢倒入柱子中，确保固定相致密，避免产生空洞。（以干法为例）缓慢加入流动相，将固定相润湿，此时可使用压力球，并且确保柱子底部的流动相已足够，避免产生气泡。在填充过程中，也可定期轻轻敲击柱子或使用真空抽气装置去除气泡，确保固定相均匀分布。

●平整表面：填充完成后，使用流动相轻轻冲洗顶部，以确保固定相表面平整。可加入少量石英砂于固定相表面，防止硅胶冲散。

*注意事项：

● 避免过度压实：填充时应避免固定相过度压实，以免影响流动性和分离效果。

● 保持均匀：确保固定相均匀分布，避免形成死区。

● 控制流速：在填充和洗脱过程中，流速应适中，过快可能导致分离效果不佳。

样品的准备（湿法上样）

● 准备样品：将待分离的样品溶解在少量的溶剂中，确保样品全部溶解。

● 将溶解好的样品缓慢加入层析柱顶部，确保样品均匀分布在固定相上。注意当湿法上样体积较大时，样品体积相对于色谱柱柱床的体积占比也会增大，扩散效应也会明显增强，会导致峰宽变宽、分离效率和纯度降低。

● 可以用少量的相同溶剂冲洗样品容器，以确保样品全部转移到层析柱中。

● 开始洗脱：在样品上方添加洗脱溶剂，开始洗脱过程，观察分离效果。

洗脱操作

通过压力球对上方进行加压，维持稳定的流速，可以加速洗脱过程。最后将最终得到的洗脱溶液进行TLC监测，可以判断目标产物的出现。去除相关溶剂，就可得到较纯的最终产物。在此过程中要注意以下几点

● 控制洗脱剂的流速：一般最佳的流速值是使得洗脱剂在柱子部分时候，液面降速为5 cm/min, 这就意味着直径较小的柱子洗脱时流速比大直径的要慢一些；

● 洗脱过程中还应注意按照载样量来确定每个fraction（通常用试管接收）的体积，避免出现前后组分交叉混合的现象。载样越大，每个fraction体积也应该越多；

● 洗脱中要尽量减少“加压–减压(放气)"的次数，避免柱子内部出现“开裂"，影响分离效果；

● 洗脱过程要密切关注液面位置，在柱层析结束前，要保证液面不低于沙子层。